甘薯茎尖脱毒及组培快繁技术

日期:2016/2/14 来源:本站原创 点击:844 

 

秦 梅1,张燕1,徐美恩1,杨发明1,陈春泉1(1.云南省楚雄州农业科学研究推广所,云南楚雄  675000)
摘要 [目的]研究甘薯茎尖分生组织的分化培养基配方及快繁培养的影响因素。[方法]以甘薯茎尖作为外植体,总结出茎尖分化培养前的灭菌方法,筛选出适宜的分化培养基配方、快繁培养基配方以及影响快繁的各项因素。[结果]结果表明:75%的酒精30s+0.1%升汞10min能取得较好的灭菌效果,降低污染率;适宜的茎尖分化培养基配方为:MS+0.5mg/L6-BA+0.2mg/lNAA+0.25m
g/LGA3+10mg/L病毒唑;快繁培养基配方为:Ms+0.1~0.2mg/LNAA+2mg/L泛酸钙;适宜的糖用量为30g/L;培养条件为温度28℃、光照2000lx、16h/d时脱毒苗茎段生根较快,侧芽萌发后节间适中,有利于提高繁殖系数。
关键词 甘薯; 茎尖培养; 快繁

Abstract  [Objective] The sweet potato stem tip meristem differentiation medium formula And the influence factors of rapid propagation cultivation. [method] with sweet potato stem tip as explant, the sterile system establishment, differentiation of stem tip cultured sterilization method, medium filtering, rapid propagation medium formula And its influence factors. [result] the results showed that 75% alcohol 30 s + 0.1% mercuric chloride 10 min can obtain good sterilization effect, reduce the pollution rate; Appropriate stem tip differentiation medium formula for: MS + BA + 0.2 mg, 0.5 mg/L6 / lNAA + 0.25 mG/LGA3 + 10 mg/L ribavirin; Rapid propagation medium formula for: Ms + 0.1 ~ 0.2 mg/LNAA + 2 mg/L calcium pantothenate; The suitable dosage of sugar 30 g/L; Culture conditions for temperature 28 ℃, light 2000 lx, 16 h/d) virus-free stem section begins to take root quickly, lateral bud germination after internode moderate, propagation coefficient is enhanced.
Keywords  sweet potato ;stem tip to develop ;rapid propagation;
甘薯(Ipomoea batatas)又名山芋、红芋、番薯、红薯、地瓜,为旋花科甘薯属一年生或多年生蔓性草本植物,富含蛋白质、淀粉、果胶、纤维素及多种矿物质,有“长寿食品”之誉,是重要的粮食、饲料和工业原料用作物,在世界粮食生产中总产排列第七位。目前我国的甘薯种植面积为600多万hm2,年产鲜薯1亿多吨,均居世界首位。甘薯耐旱、耐瘠薄,生物产量高,除食用外,还是重要的可再生能源原料之一,在保障国家粮食安全和能源安全方面的作用将日益突显。但近几年来,我国甘薯的种植面积增长比较缓慢,制约甘薯生产面积增长的主要问题是种性退化,而引起甘薯种性退化的原因主要是病毒侵染。甘薯是无性繁殖作物,主要通过蔓秧、种薯和苗繁殖,病毒易在体内积累,从而逐年加重,造成减产,我国每年因病毒病减产造成损失达40多亿。当前防治甘薯病毒病一般采用剥离茎尖分生组织,离体培养后得到脱毒苗来去除病毒,培育、繁殖和应用脱毒种薯。脱去病毒后的甘薯苗恢复了种性,生长势增强,产量提高,品质变优,增产效果极为明显,增产幅度可达80%以上,在生产上有着较好的应用前景。
本实验选取我所推广的淀粉型甘薯品种—徐薯22作为供试品种,针对甘薯茎尖分生组织培养和扩繁中培养基配方、糖用量等方面进行了研究,以期提高茎尖培养成活率和成苗率,为脱毒苗工厂化生产提供技术支持。
1 材料与方法
1.1 供试材料
于每年2月初挑选表皮光滑、正常薯形、大小均匀、无病虫害和无损伤薯块,放置在25~30℃的温室内进行催芽,一周后块茎上的芽开始萌发。
1.2 取材与消毒
当块茎上的芽丛长到10cm时,切下顶部约3cm长的芽段,剪去已展开的叶片,放入烧杯中,放入0.1%洗衣粉水中洗涤,流水冲洗20min,再用纱布吸干水分,置于超净工作台上。在无菌操作台内采用3种不同配比的消毒液进行消毒,倒去消毒液后,用无菌水漂洗5~6次,漂洗后将芽段放在灭过菌的滤纸上吸干水分。不同配比消毒剂处理时间见表1。
1.3 茎尖培养
在超净工作台上剪取约1cm长的幼茎先端约,在40倍解剖镜下切除较大的叶原基,找到位于顶端的茎尖生长点(生长点呈透明扁平的突起),用解剖针切下生长点,长度约为0.2~0.3mm(一般带1~2个叶原基),切下后,用解剖针将茎尖挑到装有培养基的三角瓶中进行培养,每瓶接种一个外植体,每接种一个茎尖后都要将解剖针放在酒精灯上烧10s,以降低操作中带来的污染。培养基为添加了不同种类、浓度生长调节剂的Ms培养基,编号为1~9,另设不加任何生长调节剂的Ms培养基作为对照,每种培养基中附加30g/L蔗糖和6g/L琼脂,PH值5.8。培养基中植物生长调节剂配比见表2。培养条件为温度25℃、光照强度2000Lx、光照时间16h/d。培养50d后统计植株高度、叶片数、根数等生长情况。
1.4 病毒检测
当茎尖苗长到6~7片叶时就可进行病毒检测,检测方法有血清学检测、电镜检测和指示植物嫁接等,最快捷的检测方法是电镜检测,可直接在电镜下观察到病毒质粒。去除检测出的带毒苗和品种特征改变或性状变差的茎尖苗,剩余的即为脱毒苗,可直接用于快繁生产。
1.5 脱毒苗组培快繁
利用茎尖分生组织培养获得脱毒苗后,要获得大量可供生产使用的种苗,快繁技术起着决定性的作用。脱毒苗快繁可以采用试管苗单叶节扦插来进行,即在无菌条件下,将茎尖苗剪切成段,每段带一节和一片叶,形态学下端扦插于加入生长调节剂的培养基中,通过生长调节剂的作用使茎段下端长出根,侧芽向上萌发形成一棵完整的植株。试验中设计了10种加入不同种类、浓度生长调节剂的培养基,以不加任何生长调节剂的Ms培养基做对照,筛选适宜的快繁培养基每处理10个重复,每瓶接入3个节段,快繁培养基不同生长调节剂配比见表3。培养条件为:温度28℃,光照强度2000Lx,光照时间16h/d,培养20d后统计植株高度、叶片数、生根数等生长情况;得出适宜的培养基配方后,设置五个处理来筛选培养基中的糖用量,每个处理30瓶,培养20天后统计株高、节间数和生根数等,结果见表4;
1.6 炼苗与移栽
甘薯脱毒苗在适宜的快繁培养基上一般30天后可长成为完整的植株,然后就可进行炼苗、移栽。炼苗时将装有小苗的培养瓶搬到15~20℃的培养室中放置5d,第6d打开培养瓶用镊子取出小苗,洗去根部残留的琼脂,再用0.1%的甲醛溶液浸泡10min,然后以5cm×5cm的株行距栽入带防虫网棚的培养床上,栽培基质可用蛭石、珍珠岩、粗沙、炉灰渣、谷壳、锯木屑等,移栽前一周进行消毒。小苗栽好后立即用喷壶喷水,再用1/800~1/1000百菌清或多菌灵喷淋,然后搭小拱棚并盖上遮阳网,每天浇水一次,成活率可达98%以上。
2 结果与分析
2.1 不同表面消毒方法对茎尖成活率和污染的影响
表1消毒方法的灭菌效果和对茎尖成活率的影响
序号 
表面消毒方法 接种数(个) 污染数
(个) 
污染率 
成活率
1 0.1%升汞溶液15min 60 5 8.33% 71.8%

2 75%的酒精30s+2%的次氯酸钠溶液10 min 
60 
13 
21.67% 
86.9%

3 75%的酒精30s+0.1%的升汞溶液10 min 
60 

5.0% 
83.4%
从试验结果来看,升汞的灭菌效果比次氯酸钠好,酒精和升汞结合起来灭菌可达到较好的效果,有效地控制污染率,但升汞渗透性强,容易损伤茎尖组织,在漂洗时需多清洗2-3次,否则影响成活率。综合不同处理的灭菌和茎尖的成活率效果,处理3是最佳灭菌选择。
2.2 不同茎尖培养基配方的效果
表2 不同生长调节剂培养基配比对茎尖组织生长的影响
处理 6-BA
(mg/L) NAA
(mg/L) GA3
(mg/L) 接种数(个) 成苗数(个) 成苗率 茎尖苗生长情况
ck 0 0 0 30 2 6.67% 茎尖生长缓慢,90天后成苗
1 0.5 0.1 0 30 8 26.67% 茎尖淡黄色,开始大小无明显变化
2 0.5 0.2 0 30 12 40.0% 茎尖逐渐转为绿色,开始生长
3 0.5 0.3 0 30 4 13.33% 茎尖淡黄色,大小无明显变化
4 1.0 0.1 0 30 7 23.33% 茎尖基部产生愈伤组织
5 1.0 0.2 0 30 10 33.33% 茎尖基部产生愈伤组织
6 1.0 0.3 0 30 5 16.67% 茎尖基部产生愈伤组织
7 0 0 0.25 30 6 20.0% 茎尖变为绿色,开始大小无明显变化
8 0.5 0.2 0.25 30 14 46.67% 茎尖绿色,30天后开始生长
9 2.0 0.2 0 30 4 13.37% 产生大量的愈伤组织,苗细弱,叶片小,叶色浅绿
试验结果显示,茎尖分生组织在不含生长调节剂的培养基中生长缓慢,成苗率低,成苗时间长。但在培养基中加入6-BA、NAA后成苗率有了很大的提高,低浓度的6-BA可促进茎尖分生组织分化出芽和根,高浓度的6-BA则会使茎尖长出愈伤组织,影响成苗率;GA3能起到促使芽伸长的作用,在培养基中加入GA3后,可缩短成苗时间,50天就可长成茎尖苗。
2.3 病毒唑对茎尖苗脱毒率的影响
病毒唑是一种核苷结构的类似物,加入培养基中对病毒有抑制作用。实验发现,在培养基中加入10mg/L的病毒唑后,脱毒率可达到75.0%。
2.4 不同生长调节剂配比对甘薯脱毒苗快繁的影响
表3不同生长调节剂对脱毒苗快繁的影响
处理 6-BA(mg/L) NAA
(mg/L) 株高
(cm) 叶片数
(片) 生根数
(cm) 小苗生长情况
1 0 0 1.95 4.26 3.5 生长正常
2 0 0.1 6.49 7.32 5.4 生长正常
3 0 0.2 7.86 8.55 6.41 生长正常
4 0 0.3 6.38 7.32 6.76 生长正常
5 0.2 0.1 3.67 6.85 5.34 茎节下端产生少量愈伤组织
6 0.2 0.2 3.17 5.67 4.84 茎节下端产生少量愈伤组织
7 0.2 0.3 3,83 4.51 3.58 茎节下端产生少量愈伤组织
8 0.5 0.1 3.93 3.74 3,28 茎节下端产生大块愈伤组织
9 0.5 0.2 2.71 5.16 2.15 茎节下端产生大块愈伤组织
10 0.5 0.3 1.12 2.18 2.23 茎节下端产生大块愈伤组织
从上表可看出,在组培快繁阶段培养基中并不需要加入6-BA,诱导生根起主要作用的生长调节剂是NAA。加入6-BA会使茎段下端产生愈伤组织,生根数减少,侧芽萌发后节间缩短,叶形变小,生长缓慢,炼苗时成活率低;而低浓度的NAA能促进脱毒苗生根,但浓度较高反而起到抑制作用,如NAA的浓度为0.3mg/L时,脱毒苗刚开始生长迅速,快繁2~3代后却出现叶片发黄,生长停止的现象。此外,在培养基中增加少量的泛酸钙(2mg/L)可促使脱毒苗生长迅速,叶片增多,20天后就可进行一次快繁,从而提高繁殖系数。
2.5 培养基中不同糖用量对脱毒苗生长的影响
培养基中的糖是试管苗生长所必不可少的碳源和能源,同时还具有调节渗透压的作用。生产中为了节约成本,可用食用糖代替蔗糖。但不同的糖用量却对繁殖系数有影响,结果见下表。
表4不同糖用量对脱毒苗生长的影响
培养基中的糖浓度(mg/L) 节间数(个) 株高(cm) 根长(cm)
0 1.0 1.51  1.06
20 7.4 5.08 11.74
30 9.5 6.24 22.38
50 9.7 6.37 23.67
80 10.2 6.45 24.49
试验结果显示,培养基中不加入蔗糖时植株没有生长,随着糖用量从0增加30g/L,节间数也从1.0增加到9.5个;但当糖用量超过30g/L时,糖用量再增加,节间数增加却并不显著,根的长度增加也较小,并且从快繁的角度来说,对增殖系数影响大的是节间数,所以在甘薯快繁培养基中糖用量为30g/L较为适宜。
2.6 适宜的培养条件:
甘薯为喜温作物,培养温度在20℃以下时,脱毒苗生长较为缓慢,下部叶片变黄,温度在28~30℃时,植株生长较快,节间适中,叶片较大;而温度超过30℃时则脱毒苗生长反而下降,叶片增加较少;光照对脱毒苗的影响主要是影响其节间的长度,光照为1000lx时,脱毒苗的节间变长,叶片发黄,影响生长。经反复试验,光照强度在2000lx,光照时间16h/d时,脱毒苗生根时间短,节间适中,茎杆粗壮,15d就长到10~12cm。
3  小结与讨论:
茎尖分生组织培养是目前培养脱毒苗,生产脱毒种薯的主要途径。实验结果表明:①在茎尖的消毒中,75%酒精30秒结合0.1%的升汞浸泡10分钟可取得较好的灭菌效果,污染率仅为5.0%。②剥离的茎尖组织诱导成苗是脱毒快繁的技术关键,在培养基中加入少量的6-BA有促进根和芽的分化并伸长的效果,但浓度过高(超过1mg/L)时会使茎尖产生愈伤组织,反而不易分化成苗,适宜的浓度为0.5mg/L;而低浓度的GA3能促进芽伸长,与6-BA和NAA结合能提高出苗率,缩短出苗时间,因此茎尖培养阶段最适宜的培养基配方为:MS+0.5mg/L6-BA+0.2mg/lNAA+0.25m g/LGA3+10mg/L病毒唑。③在培养基中加入病毒唑可有效地脱去病毒,增加茎尖苗的脱毒率,但加入病毒唑后会出现抑制茎尖的伸长,延长成苗时间,抑制的机理还有待进一步研究。④在脱毒苗快繁中,NAA是起主导作用的因素,不需要加入6-BA,加入6-BA会使茎段下端产生愈伤组织,生根数减少,叶片变小,茎杆较细,移栽时影响成活率;而0.1~0.2mg/L的NAA对甘薯茎段生根有促进作用,NAA超过0.3mg/L时则会抑制侧芽的伸长,并且培养一段时间后脱毒苗叶片变黄、干枯,停止生长,反而不利于快繁工作的开展,适宜的NAA浓度为0.1~0.2mg/L;培养基中适宜的糖浓度为30g/L。适宜的培养条件为:温度28-30℃、光照强度2000lx、光照时间16h/d。


参考文献:
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作者简介 秦梅(1974-),女,云南楚雄人,农艺师,从事组培快繁应用技术研究,E-mail:yncxzy66408@163.com

 

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